Thèse Année : 2024

Optimization of plant biomass fermentation by Lachnoclostridium phytofermentans

Optimisation de la fermentation de la biomasse végétale par Lachnoclostridium phytofermentans

Tom Zaplana
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1502534
  • IdRef : 283005661

Résumé

The development of renewable energy sources requires optimization of the conversion of plant biomass into biofuels such as butanol. Clostridia, and more specifically Lachnoclostridium phytofermentans, are anaerobic bacteria capable of degrading cellulose and producing compounds of interest, making them ideal candidates for this transformation.This thesis aims to push back the limits of metabolic engineering of L. phytofermentans to optimize butanol production. The main objectives are: (1) to develop an evolved strain capable of withstanding high concentrations of butanol, (2) to introduce a butanol synthesis pathway via synthetic biology approaches, and (3) to implement a CRISPRi system to precisely modulate central metabolism.To achieve these objectives, several approaches were implemented. L. phytofermentans was subjected to directed evolution over 480 days in a continuous culture automaton (called GM3), resulting in a butanol-resistant strain. Phenotypic and genomic characterization of this strain identified over 500 mutations associated with resistance. In parallel, a butanol synthesis pathway was designed and introduced into L. phytofermentans, and a butanol-specific biosensor was adapted to detect its production.Finally, a CRISPRi system based on dLbCas12a was developed, enabling the cloning of up to eight guides into a plasmid to specifically repress key metabolic genes.The evolved strain, PHY24.0#6, showed increased tolerance to butanol, a halved generation time and a 1.3-fold increase in maximum growth density. Analysis of the plasma membrane revealed a composition of longer, more unsaturated fatty acids. Although butanol production was not detected after introduction of the synthetic pathway, the specific biosensor was successfully integrated. The CRISPRi system was able to repress the expression of central metabolism genes up to 20-fold, including genes whose deletion would be lethal, such as the Cphy_1326-1327-0089 trio, responsible for the acetate and dihydrogen production.This work has made it possible to improve the tolerance of L. phytofermentans to butanol, and to develop innovative molecular tools such as the multiplex CRISPRi system. These advances contribute to a better understanding of this bacterium's metabolism and open prospects for optimizing the sustainable production of biofuels from plant biomass. The approaches developed could be transposed to other models of Clostridia, thereby fostering the development of innovative, environmentally friendly energy solutions.
Le développement de sources d'énergie renouvelables nécessite l'optimisation de la conversion de la biomasse végétale en biocarburants tels que le butanol. Les Clostridia, et plus particulièrement Lachnoclostridium phytofermentans, sont des bactéries anaérobies capables de dégrader la cellulose et de produire des composés d'intérêt, ce qui en fait des candidates idéales pour cette transformation.Cette thèse vise à repousser les limites de l'ingénierie métabolique de L. phytofermentans pour optimiser la production de butanol. Les objectifs principaux sont : (1) développer une souche évoluée capable de résister à de fortes concentrations de butanol, (2) introduire une voie de synthèse du butanol via des approches de biologie synthétique, et (3) implémenter un système CRISPRi pour moduler le métabolisme central de manière précise.Pour atteindre ces objectifs, plusieurs approches ont été mises en œuvre. L. phytofermentans a été soumise à une évolution dirigée sur 480 jours dans un automate de cultures continues (appelé GM3), aboutissant à une souche résistante au butanol. La caractérisation phénotypique et génomique de cette souche a permis d'identifier plus de 500 mutations associées à la résistance. Parallèlement, une voie de synthèse du butanol a été conçue et transformé dans L.phytofermentans. Un biosenseur spécifique du butanol a été adapté pour détecter sa production.Enfin, un système CRISPRi basé sur dLbCas12a a été développé, permettant le clonage jusqu'à huit guides pour réprimer spécifiquement des gènes clés du métabolisme.La souche évoluée, PHY24.0#6, a montré une tolérance accrue au butanol, un temps de génération réduit de moitié et une densité de croissance maximale augmentée de 1,3 fois. L'analyse de la membrane plasmique a révélé une composition en acides gras plus longs et plus insaturés. Bien que la production de butanol n'ait pas été détectée après l'introduction de la voie de synthèse, le biosenseur spécifique a été intégré avec succès. Le système CRISPRi a permis de réprimer l'expression de gènes du métabolisme central jusqu'à 20 fois, y compris des gènes dont la délétion serait létale, comme le trio Cphy_1326-1327-0089 responsable de la production d'acétate et de dihydrogène.Ces travaux ont permis d'améliorer la tolérance de L.phytofermentans au butanol et de développer des outils moléculaires innovants tels que le système CRISPRi multiplex. Ces avancées contribuent à une meilleure compréhension du métabolisme de cette bactérie et ouvrent des perspectives pour optimiser la production durable de biocarburants à partir de biomasse végétale. Les approches développées pourraient être transposées à d'autres modèles de Clostridia, favorisant ainsi le développement de solutions énergétiques innovantes et respectueuses de l'environnement.
Fichier principal
Vignette du fichier
2024UPASL079.pdf (52.6 Mo) Télécharger le fichier
Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04930543 , version 1 (05-02-2025)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04930543 , version 1

Citer

Tom Zaplana. Optimisation de la fermentation de la biomasse végétale par Lachnoclostridium phytofermentans. Biotechnologie. Université Paris-Saclay, 2024. Français. ⟨NNT : 2024UPASL079⟩. ⟨tel-04930543⟩
0 Consultations
0 Téléchargements

Partager

More